Introducción

El virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) es la causa de una enfermedad altamente contagiosa en cerdos caracterizada por diarrea severa entero-patogénica en lechones. El anillo cimenol, combinado con ácido cítrico, tiene un amplio efecto bactericida y fungicida, y hay indicios de que también es efectivo contra infecciones virales como la PED. El ácido cítrico potencia la acción del anillo cimenol.

Objetivo

Determinar si el anillo cimenol con ácido cítrico es capaz de prevenir la invasión por PEDV en cultivos de enterocitos porcinos.

Materiales y métodos

Ensayo realizado con células IPEC-J2 (enterocitos porcinos). Posteriormente, se usaron células Vero como hospedadoras del virus para evaluar la severidad de la infección.

Procedimiento

1. El anillo cimenol y el ácido cítrico se añadieron a los cultivos IPEC-J2 a distintas concentraciones y se pre-incubaron las células durante 1 hora.
2. Se añadió PEDV y las células se incubaron durante 4 horas.
3. Se lisaron las células IPEC-J2. Se recuperó el sobrenadante y se usó para infectar a las células Vero (250 µl de lisado), que fueron incubadas durante 2 horas.

Tratamientos

(T1) Control: células no tratadas, no infectadas
(T2) Células infectadas, no tratadas
(T3) Células infectadas y tratadas con cimenol + ácido cítrico (1:5000)
(T4) Células infectadas y tratadas con cimenol + ácido cítrico (1:2500)
(T5) Células infectadas y tratadas con cimenol + ácido cítrico (1:1000)
(T6) Células infectadas y tratadas con cimenol + ácido cítrico (1:500)

Lectura de resultados

El daño citopático se observó en las células Vero (presencia de monocapas dañadas). Para cuantificar la severidad de la infección:

1. Se midió la absorbancia a 550 nm, donde una mayor absorbancia se correlaciona con menor daño celular)
2. Se realizó el recuento de unidades formadoras de placas (PFU) por pocillo, donde títulos más bajos se correlacionan con menor daño citopático.

Resultados
Integridad monocapa

Microscopías de las monocapas de células Vero (imagen 1): se observó daño por el efecto citopático en las células Vero infectadas (presencia de monocapas dañadas) en todos los tratamientos excepto T1. T5 y T6 mostraron una mayor integridad de la monocapa. Esto es indicativo del efecto preventivo del cimenol con el ácido cítrico contra PEDV a diluciones de 1:1000 y 1:500.

En los cultivos T6 (dilución 1:500) se observó efecto citotóxico, pero, al pasarlas a medio no tratado, las células siguieron viables sin signos de citopatogenicidad tras 3 días de incubación.

Absorbancia

Los resultados de absorbancia de los cultivos (imagen 2) mostró que las absorbancias de T5 y T6 son las únicas que no difieren significativamente de T1 (no infectado). Esto demuestra que el anillo cimenol con ácido cítrico a diluciones 1:1000 y 1:500 previenen significativamente el daño celular causado por PEDV.

Titulación de PFU por pocillo

Los títulos de unidades formadoras de placas (imagen 3) indicaron que las diluciones 1:1000 y 1:500 obtuvieron un título significativamente menor (fueron capaces de prevenir el efecto citopático del virus) en comparación con el control infectado (T2).

Conclusiones

Los resultados indicaron que el tratamiento con anillo cimenol y ácido cítrico a una dilución de 1:1000 (equivalente a 1 kg/t) es capaz de reducir significativamente la invasión de enterocitos porcinos por PEDV in vitro, por lo que podrían usarse como una estrategia de prevención para la PED. Adicionalmente, a una dilución 1:500 (2 kg/t), la combinación podría usarse como tratamiento de choque en caso de brote severo de PED.

El anillo cimenol se comercializa bajo el nombre de Alquermold Natural de Biovet, S.A.